Erkläre das Prinzip der Gelelektrophorese zur Auftrennung eines Gemisches unterschiedlich langer DNA-Fragmente.

Leite mithilfe der Ergebnisse der Gelelektrophorese die Genotypen der drei untersuchten Personen ab (M 1).

Gib für die in Material 2 dargestellten DNA-Sequenzen die Aminosäuresequenzen sowie den Typ der Genmutation an (M 2).

Erkläre den Funktionsverlust des HFE-Proteins (M 2).

Erkläre den Einfluss von Hepcidin auf den Eisengehalt im Blut (M 3).

Erkläre die erhöhten Einlagerungen von Eisenverbindungen in Leberzellen bei einer Person mit Eisenspeicherkrankheit (M 2 bis M 4).

Erkläre, wie die organschädigenden Folgen der Eisenspeicherkrankheit durch die Aderlass-Therapie reduziert werden können (M 5).

Begründe die abnehmende Frequenz der Aderlässe im zeitlichen Therapieverlauf (M 5).

Prinzip der Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA-Fragmenten

• DNA-Moleküle besitzen aufgrund der Phosphatgruppen in ihrem Rückgrat eine konstante negative elektrische Ladung.

• Bei der Gelelektrophorese wird ein elektrisches Gleichspannungsfeld an eine Gelmatrix, meist aus Agarose, angelegt.

• Die DNA-Fragmente werden in die Geltaschen nahe des Minuspols (Kathode) eingefüllt und wandern im elektrischen Feld in Richtung des Pluspols (Anode).

• Das Gel wirkt dabei als molekulares Sieb, welches den Durchtritt der Moleküle behindert.

• Kürzere DNA-Fragmente können die Poren des Gels leichter und schneller passieren als längere DNA-Fragmente.

• Die Auftrennung des Gemisches erfolgt somit rein physikalisch nach der Molekülgröße bzw. der Länge der Fragmente in Basenpaaren.

• Nach Ablauf der Laufzeit haben sich die Fragmente gleicher Länge in sichtbaren Banden auf dem Gel angeordnet, die mithilfe eines Standards mit Fragmenten bekannter Länge verglichen werden können.

Herleitung der Genotypen der drei untersuchten Personen (M 1)

• Das unmutierte HFE-Gen besitzt keine Schnittstelle für das verwendete Restriktionsenzym, weshalb das PCR-Produkt in seiner ursprünglichen Länge von 158 Basenpaaren (bp) erhalten bleibt.

• Das mutierte HFE-Allel weist eine spezifische Schnittstelle auf und wird in zwei Fragmente der Längen 111 bp und 47 bp zerlegt.

• Fragmente mit einer Länge unter 100 bp (hier das 47-bp-Fragment) sind auf dem Gel aufgrund der methodischen Begrenzung nicht sichtbar dargestellt.

• Bei Person b ist auf dem Gel eine einzelne Bande bei einer Länge von 158 bp knapp unterhalb der 200-bp-Marke des Standards zu erkennen.

• Dies belegt, dass bei Person b kein HFE-Allel vom Restriktionsenzym geschnitten wurde und somit ausschließlich die unmutierte Erbanlage vorliegt.

• Der Genotyp von Person b ist demnach homozygot gesund (beispielsweise definiert als AA), was bedeutet, dass die Person phänotypisch gesund ist.

• Bei Person a zeigt das Gel ein Bandenmuster aus zwei verschiedenen Fragmenten, eine Bande bei 158 bp und eine weitere Bande knapp über der 100-bp-Marke des Standards bei 111 bp.

• Dieses Muster zeigt, dass im Erbgut von Person a sowohl ein ungeschnittenes, intaktes Allel als auch ein geschnittenes, mutiertes Allel vorhanden ist.

• Der Genotyp von Person a ist folglich heterozygot (Mischerbig, beispielsweise Aa), weshalb die Person eine gesunde Überträgerin der autosomal-rezessiven Erkrankung ist.

• Bei Person c ist auf dem Gel ausschließlich eine einzelne Bande bei einer Fragmentlänge von 111 bp zu sehen.

• Das vollständige Fehlen der 158-bp-Bande beweist, dass bei dieser Person alle vorhandenen HFE-Gene die Mutationsschnittstelle aufweisen und vollständig geschnitten wurden.

• Der Genotyp von Person c ist somit homozygot mutiert (beispielsweise aa).

• Da die Eisenspeicherkrankheit autosomal-rezessiv vererbt wird, führt dieser genotypische Zustand dazu, dass Person c an der Eisenspeicherkrankheit leidet.

Ermittlung der mRNA-Sequenzen und der Aminosäuresequenzen

• Der vorgelegte DNA-Ausschnitt stammt aus dem nicht-codogenen Strang des HFE-Gens, welcher bei der biologischen Transkription nicht als Matrize dient.

• Die Sequenz der zugehörigen mRNA ist daher sequenzidentisch mit diesem Strang, wobei lediglich die Base Thymin durch Uracil ausgetauscht ist.

• Für das nicht mutierte HFE-Gen lautet die mRNA-Sequenz in der klassischen Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende folglich: 5'-UAU ACG UGC CAG-3'.

• Mithilfe der Codesonne wird diese mRNA-Sequenz von innen nach außen in die entsprechende Aminosäuresequenz übersetzt.

• Die Aminosäuresequenz des nicht mutierten Genabschnitts lautet somit: Tyrosin - Threonin - Cystein - Glutamin.

• Für das mutierte HFE-Gen ergibt sich auf dieselbe Weise die veränderte mRNA-Sequenz: 5'-UAU ACG UAC CAG-3'.

• Die Übersetzung mittels Codesonne liefert für das mutierte dritte Codon UAC nun die Aminosäure Tyrosin (Tyr) anstelle von Cystein.

• Die Aminosäuresequenz des mutierten Proteinabschnitts lautet demnach: Tyrosin - Threonin - Tyrosin - Glutamin.

Bestimmung des Typs der Genmutation

• Ein direkter Vergleich der beiden Nukleotidsequenzen zeigt, dass an der achten Position des betrachteten Ausschnitts die Base Guanin durch die Base Adenin ausgetauscht wurde.

• Es handelt sich bei diesem molekularen Vorgang um eine Punktmutation in Form einer Basensubstitution.

• Da dieser Basenaustausch im Verlauf der Translation zum Einbau einer anderen Aminosäure in die Polypeptidkette führt, liegt eine Fehlsinn-Mutation (Missense-Mutation) vor.

Erklärung des Funktionsverlusts des HFE-Proteins

• Durch die Missense-Mutation kommt es zu einem Austausch einer Aminosäure: Cystein wird durch Tyrosin ersetzt.

• Dadurch verändert sich die Primärstruktur des HFE-Proteins.

  → veränderte Wechselwirkung zwischen den Aminosäuren des HFE-Proteins

  → Strukturveränderung des HFE-Proteins in für die Funktion des HFE-Proteins wichtigem Bereich

  → Funktionsverlust des HFE-Proteins

Erklärung des Einflusses von Hepcidin auf den Eisengehalt im Blut

• Eisen aus der Nahrung wird im Verdauungstrakt in Form von -Ionen aufgenommen.

• Die gezielte Passage dieser -Ionen aus dem Dünndarminnenraum in das menschliche Blut erfolgt über die Dünndarmzellen.

• Für den lebenswichtigen Ausschleusungsprozess der -Ionen aus dem Zytoplasma der Dünndarmzellen in die Blutbahn ist das spezifische Membranprotein Ferroportin verantwortlich.

• Nach dem erfolgreichen Übertritt in das Blut binden die freien -Ionen an das im Blut befindliche Transportprotein Transferrin.

• Das regulatorische Protein Hepcidin wird in der Leber gebildet und steuert die Intensität dieser Eisenaufnahme.

• Liegt eine hinreichende Konzentration von Hepcidin vor, bindet dieses Protein direkt an die Ferroportin-Kanäle auf der dem Blut zugewandten Seite der Dünndarmzellen.

• Diese spezifische Bindung blockiert den Kanal und leitet den unmittelbaren Abbau des Ferroportin-Proteins ein.

• Durch den fortschreitenden Abbau der intakten Ferroportin-Transporter wird der physiologische Stofftransport von -Ionen in die Blutbahn unterbrochen.

• Als direkte Konsequenz dieses regulatorischen Eingriffs verringert Hepcidin die Aufnahme neuer -Ionen in den Kreislauf.

• Auf diese Weise übt das Protein Hepcidin einen direkt senkenden und begrenzenden Einfluss auf den gesamten Eisengehalt im Blut aus.

Regulationsstörung bei einer Person mit Eisenspeicherkrankheit

• Bei gesunden Personen führt ein erhöhter Eisengehalt im Blut dazu, dass vermehrt eisenbeladenes Transferrin an die Transferrin-Rezeptoren der Leberzellen bindet.

• Diese Bindung bewirkt unter funktioneller Beteiligung des intakten HFE-Proteins und des Transferrin-Rezeptors 2 die Auslösung einer intrazellulären Signalkaskade.

• Die aktivierte Signalkaskade stimuliert im Zellkern die Transkription des Hepcidin-Gens zu mRNA, welche anschließend an den Ribosomen in das regulatorische Protein Hepcidin übersetzt wird.

• Bei einer Person mit der Eisenspeicherkrankheit liegt jedoch eine Mutation im HFE-Gen vor, die zu einem tiefgreifenden Funktionsverlust des HFE-Proteins führt.

• Aufgrund dieses strukturellen Defekts kann an der Zellmembran der Leberzelle die reguläre Signalkaskade zur Aktivierung des Hepcidin-Gens selbst bei hohen Eisenkonzentrationen nicht mehr initiiert werden.

• Infolgedessen unterbleibt die Genexpression, sodass keine mRNA gebildet und somit kein funktionsfähiges Hepcidin mehr von den Leberzellen ausgeschüttet wird.

Auswirkungen auf die Eisenaufnahme im Dünndarm und Einlagerung in der Leber

• Da im Blutkreislauf der betroffenen Person das Protein Hepcidin fehlt, unterbleibt der signalisierte Abbau des körpereigenen Transportproteins Ferroportin in den Dünndarmzellen.

• Ohne den abbauenden und regulierenden Einfluss von Hepcidin verbleiben die Ferroportin-Kanäle dauerhaft in einem voll funktionsfähigen und aktiven Zustand in der Zellmembran.

• Dies hat zur Folge, dass die Passage von -Ionen aus der Nahrung über den Dünndarminnenraum ins menschliche Blut dauerhaft gesteigert und vollkommen unkontrolliert abläuft.

• Das Transportprotein Transferrin nimmt diese überschüssigen Mengen an -Ionen im Blut auf und transportiert sie durch den gesamten Kreislauf zu den verschiedenen Organen.

• Vor allem die Leberzellen absorbieren diese im Blut im Übermaß zirkulierenden -Ionen fortlaufend in sehr großen Mengen.

• Da die Aufnahmekapazität der Zellen durch den permanenten Einstrom chronisch überlastet wird, kommt es in den Leberzellen zu massiven, pathologischen Einlagerungen von Eisenverbindungen.

• Diese extrem hohen Konzentrationen an gespeicherten Eisenverbindungen überschreiten die Toleranzgrenze des Gewebes weit, was letztlich zu irreversiblen Organschäden in der Leber führt.

Reduktion der organschädigenden Folgen durch die Aderlass-Therapie

• Bei einem Aderlass werden dem betroffenen Patienten zu Beginn der Therapie einmal pro Woche gezielt 300-500 ml Blut entnommen.

• Durch diese Entnahme wird dem Körper direkt eine erhebliche Menge des im Blut beziehungsweise im Hämoglobin der roten Blutkörperchen gebundenen Eisens physisch entzogen.

• Der Körper gleicht das fehlende Flüssigkeitsvolumen im Blutkreislauf zwar schnell aus, muss jedoch die verlorenen roten Blutkörperchen durch Neubildung ersetzen.

• Für diese Neubildung von Hämoglobin und roten Blutkörperchen benötigt der Organismus zwingend -Ionen.

• Da die pathologische Einlagerung von Eisenverbindungen in den Organen reversibel ist, kann der Körper auf diese künstlich herbeigeführte Schwankung des Eisengehalts im Blut reagieren.

• Der Organismus mobilisiert das in den Zellen von Leber und Herz festsitzende Speicher-Eisen und gibt es in die Blutbahn ab, um den akuten Bedarf der Blutbildung zu decken.

• Durch diesen fortlaufenden Prozess der Eisenmobilisierung wird die chronische Eisenüberladung in den betroffenen Organen schrittweise abgebaut, wodurch die organschädigenden Folgen effektiv minimiert oder sogar rückgängig gemacht werden.

Begründung der abnehmenden Frequenz der Aderlässe im Therapieverlauf

• Zu Beginn der medizinischen Behandlung weisen die Patienten aufgrund der jahrelangen Regulationsstörung extrem volle und überladene Eisenspeicher in ihren Organen auf.

• Um diese massiven, gesundheitsschädlichen Eisenüberladungen in kurzer Zeit wirksam zu reduzieren, ist in der Anfangsphase eine sehr hohe Frequenz von einem Aderlass pro Woche zwingend erforderlich.

• Im späteren Verlauf der Therapie sind die überschüssigen, organschädigenden Eisenverbindungen durch die regelmäßigen Blutentnahmen erfolgreich aus den Speichern entfernt worden.

• Sobald ein physiologischer Normalzustand des Eisengehalts erreicht ist, ändert sich das therapeutische Ziel von einer akuten Entleerung der Speicher hin zu einer reinen Erhaltung dieses stabilen Niveaus.

• Es muss ab diesem Zeitpunkt nur noch diejenige Menge an Eisen aus dem Körper entfernt werden, die über die Nahrung unkontrolliert durch den Dünndarm neu in das Blut gelangt.

• Da die kontinuierliche Zufuhr von Eisen über die Nahrung im Vergleich zu den anfangs vorhandenen, massiven Speichermengen sehr langsam abläuft, reichen im späteren Verlauf zwei bis vier Aderlässe pro Jahr völlig aus, um die Balance zu halten.